Reverse transcriptase pcr là gì

Xét nghiệm sinc hóaXét nghiệm tiết họcXét nghiệm máu tụ - miễn dịchXét nghiệm thủy dịch - vi sinhXét nghiệm di truyền và SHPT
*

*

*

*

*

Nhóm đồ vật làm lạnhNhóm máy làm nóngNhóm lắp thêm cơ họcNội thất Phòng thí nghiệmCân/pH/Lọc/Pipet/Bơm...

Bạn đang xem: Reverse transcriptase pcr là gì


Hóa hóa học cơ bản/phân tíchHóa hóa học sinc họcSinc phẩm xét nghiệmPipet/Vật tư tiêu haoHóa hóa học sinh học tập phân tử
Các kỹ thuật phân tíchCác nghệ thuật rước mẫuPhân nhiều loại môi trườngCác dự án công trình môi trường thiên nhiên - Chuyển giao công nghệMôi trường và cuộc sống
christmasloaded.com

PCR phiên mã ngược định lượng (RT-qPCR) là chuyên môn PCR định lượng với khuôn lúc đầu là ARN. ARNđược phiên mã ngược thành ADNcvà sử dụng làm cho khuôn đến phản ứng qPCR. Kỹ thuật này được áp dụng rộng thoải mái trong vô số nhiều nghành bao gồm phân tích bộc lộ gen, xácnhấn iARN (RNAi validation), chứng thực microarray (microarray validation), phát hiện sinh vật tạo dịch, test nghiệmDT với nghiên cứu và phân tích dịch.

1. RT-qPCR một bước cùng nhị bước

RT-qPCR có thể được thực hiện theo phương thức một bước với nhị bước. Với thứ hạng RT-qPCR một bước, quy trình tiến độ tổng vừa lòng ADNccùng qPCR được thực hiện vào cùng một ống làm phản ứng bằng cùng một enzym. Pmùi hương thức này chỉ rất có thể thực hiện mồi đặc hiệu. trái lại, với phương thức RT-qPCR nhị bước, quá trình tổng thích hợp ADNcvới qPCR được tiến hành vào nhì ống phản ứng lẻ tẻ cùng với enzym, đệm, nhân tố và điều kiện bội phản ứng được về tối ưu cho mỗi giai đoạn. Ưu cùng điểm yếu của nhì cách tiến hành RT-qPCR này được trình bày trong Bảng 1.

Bảng 1. So sánh nhị thủ tục RT-qPCR một bước và hai bước

Ưu điểmNhược điểm
Một bước

– Ít không nên số do cả nhị bội nghịch ứng diễn ra vào và một ống bội nghịch ứng

– Giảm nguy cơ lây lan vì chưng ít thao tác pipet

– Phù phù hợp mang lại phần lớn ứng dụng khuếch đại/lựa chọn bao gồm đầu vào mẫu cao, nkhô hanh và ổn định định

– Không thể buổi tối ưu lẻ tẻ đến hai tiến trình của phản ứng

– Ít nhạy cảm rộng RT-qPCR nhị bước do yếu tố phản ứng đề nghị phẳng phiu cho tất cả 2 phản bội ứng phiên mã ngược với qPCR

– Phát hiện tại được không nhiều gen đích rộng trong một mẫu

Hai bước

– Tạo ra các thành phần hỗn hợp ADNcbền,hoàn toàn có thể tàng trữ lâu hơn với dùng mang lại nhiều phản bội ứng

– Cho phxay khuếch tán cùng lúc gen đích với ren tham chiếu

– Mỗi quy trình của bội nghịch ứng hồ hết được tối ưu hóa

– phần lớn chắt lọc mồi phiên mã ngược

– Sử dụng những ống phản bội ứng với thao tác làm việc pipet tăng nguy cơ lây truyền ADNcùng tốn thời gian hơn

– Cần về tối ưu nhiều hơn nữa RT-qPCR một bước

*

Hình 1. So sánhhai phương thức RT-qPCR một bước cùng nhị bước

2. Lựa lựa chọn thân ARNtổng thể vàmARN

Phản ứng RT-qPCR thử khám phá khuôn là ARN, ARNnày hoàn toàn có thể bên trong hỗn hợp ARNtổng thể hoặc chỉ riêng biệt mARN. Tách tách ARNtổng thể yên cầu không nhiều bước triển khai hơn tinh không bẩn riêng mARNhỗ trợ cho công suất tách chiết cao hơn đôi khi thuận lợi rộng lúc định mức lượng tế bào đầu vào. Ngoài ra, vị không tồn tại bước làm cho giàu riêng biệt mARN, thực hiện ARNtổng cộng không gây khác biệt trong năng suất bóc tách phân tách những loại mARNkhác nhau. Tuy thực hiện mARNtinch sạch mát giúp phản bội ứng có độ nhạy cảm cao hơn một chút ít, dẫu vậy vì chưng cùng với phản bội ứng PCR định lượng, trong đa phần những ứng dụng, định lượng kha khá của các ARNđích đặc biệt quan trọng hơn định lượng hoàn hảo của chúng, nên các ưu cố kỉnh bên trên của ARNtổng thể khiến cho đấy là vật tư khởi đầu cân xứng cho làm phản ứng RT-qPCR.

3.

Xem thêm: Tại Sao Không Vào Được Facebook Bằng Máy Tính

Mồi mang đến bội nghịch ứng phiên mã ngược

Phương thơm thức RT-qPCR hai bước có thể chấp nhận được thực hiện những loạimồi khác biệt trongbội phản ứng phiên mã ngược (Hình 2, Bảng 2). Mồi này đang links bổ sung cùng với khuôn ARNvới làm cho điểm bắt đầu mang lại bội phản ứng tổng thích hợp ADNc. Hai nhiều loại mồi thường xuyên được sử dụng phổ biến là oligo dT và mồi tình cờ.

*

Hình 2. Các một số loại mồi khác nhau cho làm phản ứng phiên mã ngược

Bảng 2. Các mồi được sử dụng cho bước tổng phù hợp ADNccủa RT-qPCR. Mồi oligo dT và mồi tự dưng thường được kết hợp sử dụng nhằm tăng năng suất phiên mã ngược cùng độ nhạy cảm của qPCR

Các một số loại mồiCấu trúc và chức năngƯu điểm

Nhược điểm

Oligo dT (hoặc Oligo dT dạng neo)– Là một chuỗi Timin (đã links cùng với đuôi polyA của những mRNA).- Oligo dT dạng neo gồm thêm G,C hoặc A ở đầu 3’– Giúp tổng thích hợp ARNnguyên ổn vẹn trường đoản cú mARNbao gồm đuôi polyA- Phù phù hợp với lượng mẫu áp dụng ít- Cấu trúc neo đảm bảo mồi đang link vào đuôi polyA làm việc đầu 5’ củamARN– Chỉ số lượng giới hạn cùng với những mARNbao gồm đuôi polyA- ADNcdễ bị thiếu hụt đoạn trường hợp oligo dT bám vào đoạn polyA ở giữa củamARN- Ưu thánh sư lên đoạn 3’ củamARN
Mồi ngẫu nhiênDài khoảng chừng 6-8 nucleotide, link với rẩt những địa chỉ trênARN– Sử dụng được với toàn bộ các một số loại ARN(rARN, mARNcùng tARN)- Phù vừa lòng cho những khuôn ARNcó không ít vùng cấu trúc bậc nhị, hoặc lượng mẫu nguồn vào thấp- Hiệu suất tổng thích hợp ADNccao– ADNcđược tổng vừa lòng từ bỏ toàn bộ các ARN, trong các số đó có tương đối nhiều ARNkhông mong muốn có tác dụng giảm tín hiệu từmARN- ADNcko nguim vẹn
Mồi sệt hiệuĐược kiến tạo đặc hiệu trên đoạn trình từ đích– Tổng vừa lòng các ADNcquánh hiệu- Tăng độ nhạy- Là thiết yếu mồi ngược của cặp mồi qPCRChỉ tổng hợp được ADNcxuất phát điểm từ 1 gen đích

Enzym phiên mã ngược

Đây là loai nghiêm enzym tiến hành bội phản ứng phiên mã ngược, tổng vừa lòng ADNctrường đoản cú khuôn ARN. Một số enzym tất cả hoạt tính RNAseđược cho phép phân diệt khuôn ARNsau khi đã tổng hợp ADNc. Nếu enzym không tồn tại hoạt tính này, có thể yêu cầu bổ sung RNAse nhằm mục đích tăng tác dụng của qPCR. Loại enzym phiên mã ngược thường được sử dụng là enzym phiên mã ngược của vi khuẩn ung thỏng bạch cầu chuột moloney (M-MLV) với vi khuẩn cúm gia vậy (AMV). Tiêu chuẩn chỉnh của một enzym phiên mã ngược lphát minh đến phản bội ứng RT-qPCR là tất cả độ bền nhiệt giỏi, được cho phép tổng thích hợp kết quả ADNcnghỉ ngơi ánh sáng cao hơn phần đông khuôn ARNcó tương đối nhiều vùng kết cấu bậc hai.

Hoạt tính của RNAse H trong RT-qPCR

RNAse H có hoạt tính phân giải khuôn ARNvào cấu tạo mạch song ARN-ADoanh Nghiệp giúp tăng hiệu suất tổng đúng theo mạch song ADNtừ bỏ ADNc. Tuy nhiên với đa số mARNnhiều năm, ARNcó thể bị phân hủy dẫn cho ADNctổng phù hợp bị ngắn thêm đi, do thế hoạt tính RNAse H thường bị hạn chế nhằm có thể nhân mẫu ADNctự hầu hết mARNlâu năm. trái lại, phần đa enzym phiên mã ngược có tích đúng theo hoạt tính RNAse H hay rất được yêu thích rộng trong phản nghịch ứng RT-qPCR bởi vì bọn chúng tăng cường tài năng trở nên tính kết cấu mạch kxay ARN-ADoanh Nghiệp vào chu kỳ luân hồi đầu tiên của PCR (hình 3).

Thiết kế mồi qPCR

Cặp mồi lý tưởng phát minh cho phản ứng qPCR trong RT-qPCR hay được thiết kế với ở quấn qua địa điểm nối thân hai exon. Một vào nhị mồi vẫn nằm nắm ngang địa chỉ nối giữa 2 exon này, khiến cho mồi chỉ bắt cặp quánh hiệu cùng với ADNcmà quan yếu liên kết với ADNtổng cộng bởi sinh hoạt ADNtoàn bô đựng intron ở xen giữa những exon (Hình 4). Thiết kế này góp thải trừ nguy cơ tiềm ẩn khuếch tán nhầm ADNtổng thể.

Nếu thiết yếu kiến thiết mồi trùm qua địa chỉ nối thân exon hoặc vị trí 2 exon được ngăn cách bươi intron dài, rất cần được xử lý mẫu mã ARNvới enzyme RNAse-không tính tiền DNAse I hoặc ds-DNAse để sa thải ADNtổng thể.

Đối triệu chứng mang đến RT-qPCR

Đối triệu chứng phiên mã ngược âm hay được đi theo tất cả các thí nghiệm RT-qPCR nhằm mục đích soát sổ sự lây nhiễm ADN(ADN tổng thể hoặc sản phẩm PCR trường đoản cú đa số thử nghiệm trước đó). Đối bệnh này đựng cục bộ hầu hết thành phần của làm phản ứng trừ enzym phiên mã ngược. Phản ứng phiên mã ngược quan trọng ra mắt, do thế ví như thành phầm khuếch tán được phát hiện tại trong đối hội chứng âm này, thì hết sức có thể bọn chúng bắt đầu từ ADNlây nhiễm vào.